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抵抗氣溶膠造成的模板污染,Luna qPCR試劑有妙招

版權所有,轉載請聯系基因市場部
2019-05-07

核酸氣溶膠污染大概是分子生物學實驗室最痛恨的東西之一,經常與PCR實驗相伴出現。所謂核酸氣溶膠,是指懸浮于氣體介質中的直徑為0.001~1000微米的,含有核酸的液體微小粒子,廣泛存在于實驗室桌面、儀器、耗材及空氣中。由于RNA容易被降解,所以帶來危害的主要是DNA氣溶膠。核酸氣溶膠落入PCR反應體系中,會成為擴增的模板,導致檢測結果出現假陽性。


想知道您的實驗環境中是否存在氣溶膠污染,只需要設置一個空白對照,即不含模板DNA,但含有PCR體系中所有其他成分的對照反應。若空白對照中出現擴增產物,我們認為PCR的結果是不可信的。對于靈敏度更高的qPCR實驗來說,痕量的氣溶膠污染都可能造成實驗結果的假陽性。


酒精擦拭、紫外照射、氣溶膠污染清除劑等,都是用于處理環境中的污染的辦法,但是當空氣中的核酸氣溶膠可能落入PCR試劑,造成持續性污染時,往往就只能丟棄試劑。針對這一問題,NEB給出了新的解決方案。Luna通用型qPCR預混液中使用了dUTP,從而可以在擴增過程中將U摻入到DNA產物中。因此,即使擴增產物變成氣溶膠,造成了污染,也可以通過在反應體系中加入終濃度0.2 units/μl 的南極熱敏尿嘧啶 DNA 糖基化酶(簡稱南極熱敏UDG,M0372),25℃溫育10分鐘來完全解決。南極熱敏UDG能有效地水解DNA上的尿嘧啶,產生缺嘧啶位點。后者在高溫下極易水解斷裂,從而達到降解氣溶膠模板的效果。同時該酶對高溫敏感,在后續的qPCR的變性步驟中就可以被完全失活,因此不會影響正在進行的檢測。

NEB Luna去除模板污染示意圖

此外,預混液中還加有非熒光染料,便于建立反應時進行肉眼觀察,該染料的光譜與 qPCR 熒光染料不重疊,因此不會影響到實時檢測數值。


經過優化的NEB Luna Universal qPCR Master Mix含有熱啟動 Taq DNA 聚合酶及獨特校正染料,在大部分具有SYBR?/FAM通道的qPCR設備上都有出色的表現,而且無需額外添加ROX進行校正。

使用 Luna Universal qPCR Master Mix 檢測目標中 GAPDH 基因的表達情況,模板為 6個分別 10 倍稀釋的 Jurkat cDNA (20 ng – 0.2 pg),每個濃度的樣品做8個復孔。cDNA 是使用 NEB Protoscript? II First Strand cDNA Synthesis Kit (E6560) 從 Jurkat 的總 RNA 反轉錄得來。


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